Один день на работе биологини

 Публичный пост
11 декабря 2021  1791
ОХУЕННО ⨯6 Я понял! ⨯2

Я работаю и учусь в аспирантуре в детской онкобольнице в Нидерландах. Ищу новые лекарства от рака крови. Большу́ю часть моей работы составляет так называемая мокрая биология — это когда вместо того, чтобы нажимать на клавиатуру и пялиться в белые буквы на чёрном экране компьютера, торчишь в лабе и ставишь руками эксперименты. Мне захотелось поделиться, из каких именно действий состоит моя рутина в лабе. Для этого я выбрала один более-менее репрезентативный рабочий день, описание которого и есть этот пост.

Начало дня

Я встала затемно и спешу в больницу. Сегодня важный день — предстоит процедура, один прогон которой стоит полторы тыщи евро. Нужно будет всё тщательно приготовить и орудовать внимательно.

Первым делом я иду в офис — снять куртку и взять протоколы эксперимента.

Сложные эксперименты (сегодня кусок как раз такого) я люблю планировать, рисуя их схемы. Вот схема текущего эксперимента.

Суть эксперимента

Клетки рака крови (лейкемии) развиваются в костном мозге. Они там не одни, а окружены другими, нормальными клетками костного мозга. И не просто окружены, а ещё как-то с ними взаимодействуют. Я хочу поподробней изучить эти взаимодействия при помощи ко-культуры: беру лейкемические клетки, беру нормальные клетки костного мозга, сажаю их вместе и смотрю через несколько дней, что получится.

Как именно смотрю, что получится? Это можно делать разными методами. Сегодняшний метод — секвенирование РНК.

Что такое секвенирование РНК? Давайте сначала разберёмся, что такое РНК. Вы, может, помните из старшей школы, что клетки кучу всего делают при помощи белков. Например, при помощи белков они катализируют химические реакции внутри себя и коммуницируют с другими клетками. Вся инфа про все белки, которые потенциально может производить клетка, хранится в ДНК этой клетки. В этом смысле ДНК можно сравнить с жёстким диском — там тоже записана инфа, при помощи которой компьютер может делать какие-нибудь полезности. Когда клетке нужно произвести бело́к, она не считывает инфу с ДНК напрямую в бело́к. Сначала она производит молекулу-посредницу — РНК. Продолжая аналогию с компьютерной памятью, тут мы можем сказать, что клетка вытаскивает какую-то инфу со своего жёсткого диска (ДНК) в оперативную память (РНК), и уже потом в оперативной памяти (РНК) делает с этой инфой что-то полезное (бело́к).


(Поздравляю, вы только что познакомились с большой частью так называемой центральной догмы молекулярной биологии.)

То, какие именно куски жёсткого диска клетка воспроизводит в своей оперативной памяти и какие белки́ она производит, определяет, какая именно это клетка. Так, закодированная в ДНК инфа примерно одинакова в большинстве клеток организма — однако же при этом клетки, скажем, печени и глаза функционально и внешне очень разные.

Если взять и определить, сколько в некоторой клетке или некотором наборе клеток было каких белков в некоторый момент, то мы сможем прикинуть, что это были за клетки и чем они занимались в этот момент.

Однако по техническим (химическим) причинам сложно определить, сколько каких было белков в некотором наборе клеток. Гораздо проще определить, сколько каких РНК было в этом же наборе клеток. Учитывая, что человечество уже поставило в примерно однозначное соответствие известные белок-кодирующие РНК и известные белки, «инвентаризация» РНК даёт нам неплохую оценку гипотетической «инвентаризации» белков в том же наборе клеток. Такая «инвентаризация» РНК и называется секвенирование РНК — от английского sequencing, прочтение последовательности.

Раковые клетки занимаются хрен пойми чем и похожи хрен пойми на что, поэтому для рака особенно актуально прикидывать, чем он там занимается и на что он похож.

Кроме того, разные раковые клетки в одном и том же пациенте могут заниматься разным хрен пойми чем, поэтому актуально прикидывать, чем занимаются разные раковые клетки из одной опухоли. Это стало возможным в последние годы — человечество добилось в секвенировании РНК разрешения не в мелкие кусочки ткани из десятков тысяч клеток вместе, а прямо в единичные клетки. Процедура так и называется — секвенирование РНК единичных клеток.

Известная в кругах сингл-селльщиков картинка, сравнивающая секвенирование единичных клеток с классическим секвенированием. Авторы на картинке.

Именно к секвенированию единичных клеток я и готовлю свои клетки сегодня. Вдобавок мне нужно приготовить ещё одну порцию клеток к небольшому контрольному эксперименту — убедиться, что препарат, которым я их обработала недавно, сработал правильно (ответвление "confirm KD" на экспериментальной схеме).

Таким образом, мне сегодня нужно взять клетки, которые я растила перед этим несколько дней, убить их и приготовить к двум веткам экспериментального протокола — (1) секвенирование единичных клеток и (2) подтверждение работы препарата.

Продолжение дня

Я сгребаю в офисе все нужные протоколы, блокнот, ручку и иду в лабу. Лаба состоит не из одной комнаты, а из нескольких, разделённых по назначению (например, склад пластика, склад химреактивов, комната с микроскопами) и по уровню опасности. По этим разным комнатам я собираю нужные мне сегодня предметы (контейнер со льдом, фильтры, навеска реагента, чистый халат, etc.) и иду в комнату, где мне предстоит выполнить начальную часть сегодняшней работы, — в клеточный блок.

Так как сегодняшняя работа — с живыми клетками, то мне нужны стерильные условия. Стерильность достигается работой в специальном ящике, воздух внутри которого продувается особым образом. Ящик общий, захламлять его нельзя, поэтому по умолчанию там есть не все нужные мне предметы. Так что собранные мной предметы я должна засунуть туда сама и по окончании работы вытащить. Вот мой готовый к работе ящик:

Готово, можно наконец вытаскивать клетки. Они растут на чашках, плашках и матрасиках (не спрашивайте, я не знаю, почему в русском языке они так называются) вот в таком инкубаторе при 37⁰C:

Первым делом я несу свои плашки с клетками под микроскоп — посмотреть, как они там поживают вообще.

В микроскоп можно смотреть и камерой, как на фото выше, и глазами. Глазами видно вот такое:

Клетки поживают вроде норм, можно тратить деньговремя на дальнейшие действия с ними.

Несу плашки в «стерильный ящик» и отделяю их от лунок плашки (некоторые клетки прям крепко прилепляются) специальным реагентом. В руке у меня автоматическая пипетка — пожалуй, главный инструмент большинства мокрых биологов.

Чтобы избавиться от среды, в которой клетки росли, я их сую в центрифугу. В крутящейся центрифуге клетки садятся на дно пробирки, а жидкость потом можно сверху отобрать и выкинуть.

Сначала я работаю с клетками для того маленького контрольного эксперимента. Их, открученные в центрифуге, я заливаю специальным раствором и переношу в новые пробирки — маленькие, подписанные как следует.

Эти 2 пробирки можно сразу после этого кинуть в морозилку на -80⁰C и завершить их процессинг как-нибудь потом. Что я и проделываю.

Теперь очередь клеток для Большого и Важного Секвенирования Единичных Клеток. Их надо посчитать. Это делается при помощи смешивания клеток с красителем, который красит дохлые клетки и не красит живые, и нанесения этой смеси на размеченное на квадратики предметное стекло:

Дальше я считаю под микроскопом, сколько живых и мёртвых клеток в одном квадратике.


Эта фотография не очень хорошая, потому что на ней не видно ни одной мёртвой клетки, все живые. Извините. И да, у нас есть автоматическая клеткосчиталка. И нет, глазами посчитать всё ещё точнее.

По результатам этих расчётов я прикидываю, из каких лунок моей плашки мне лучше взять клетки на сегодняшний эксперимент — я заблаговременно засеяла несколько лунок с разным содержанием клеток, потому что не была уверена, быстро ли будут расти эти клетки.

Стерильность после этого мне не нужна — я всё равно убью клетки через пару часов, они не успеют ничем зарасти. Зато мне нужен лёд, чтобы замедлить в клетках метаболизм и оставить их состояние максимально близким к тому, в каком они были получасом ранее в инкубаторе. Поэтому я перемещаюсь из стерильного ящика на стол и в коробку со льдом. Теперь важно работать чётко и быстро.

На столе в коробке со льдом я помечаю клетки из разных образцов разными молекулами, чтобы потом оба образца можно было объединить и процессить вместе, а потом смочь различить, какая клетка относилась к какому образцу. Так дешевле — не 3000 евро за прогон, а всего-то 1500. На макроуровне это мечение выглядит как переливание автоматической пипеткой из пробирки в пробирку жидкостей, которые выглядят как вода, и центрифугирование этих пробирок. Я не стала это фотографировать.

После мечения сгребаю клетки (в смысле, пробирки с ними) — и перемещаюсь из клеточного блока в сингл селл лабу, где так же достаю из холодильников, морозилок и шкафов нужные объекты.

Дальше идёт самая ответственная часть дня — как раз та, где можно одним неверным движением пипетки запороть полторы тыщи евро. Я не сфотографировала её в подробностях, потому что не могла одновременно хорошо фотографировать и работать предельно внимательно. Но сфотографировала немного.

Суть процедуры в том, что для получения разрешения в одну клетку при секвенировании мне надо клеточную суспензию раздербанить по отдельным клеткам и как-то их обработать отдельно друг от друга. В используемом мной методе это достигается помещением капелек водного раствора с отдельными клетками в масло. Для этого-то и нужен чип с предыдущей фотографии. В одну лунку чипа я помещаю клетки в водном растворе, в другую масло. Лунки соединены микроканальцами. И вот что происходит, если в лунки чипа «подуть»:

Картинка со страницы Zida Lab.

Дутьём занимается вот эта машинка.

Спустя 18 минут машинкиной работы я достаю из чипа эмульсию капелек с клетками и реактивами в масле. Эмульсия выглядит хорошо.

Эту эмульсию в этой крошечной пробирочке я помещаю в машину, которая поддерживает заданную последовательность температур в течение заданных времён — чтобы реагенты в капельках в эмульсии активировались, разрушили клетки и перевели инфу из РНК в них в более стабильный формат (РНК разлагается как падла летающими в воздухе нуклеазами).

После этой инкубации можно переместить эмульсию в холодильник и на сегодня выдохнуть. Ура, сегодня я не запорола эксперимент. Завтра продолжу работу с эмульсией и дальнейшие попытки не запороть эксперимент — до получения данных там ещё порядочно шагов на ещё пару тысяч евро.

Можно пойти пообедать и вторую половину рабочего дня заниматься совещаниями и анализом данных с более раннего сингл селл эксперимента — второе делается на суперкомпьютере без визуального интерфейса путём печатания белых буковок на чёрном экране командной строки. Я не стала фоткать, как я пишу код, потому что это, наверное, тут многим и так знакомо. =)

Завершу рассказ фотографией здания нашей больницы. Мне нравится в ней работать. Гулять в обед по лугу за больницей тоже нравится.

Связанные посты
26 комментариев 👇
Mikael Barsehyan , embedded software engineer 11 декабря 2021

😱 Комментарий удален его автором...

  Развернуть 1 комментарий

@mbarse, термин ELI5 обозначает просто схему? Я быстро погуглила, но не поняла.

Сдерживающие NDA скорее есть на схему с результатами, чем на статью, потому что у учёных продуктом является статья. Статью скину, когда будет, если ещё будет интересно. Конкретно с результатами этого эксперимента она будет эдак через год.

  Развернуть 1 комментарий

@e_rubecula, ELI5 = 'Explain [this to me] Like I'm Five''объясни [мне это] як будто я пятилетний (ребёнок)'

  Развернуть 1 комментарий

😱 Комментарий удален его автором...

  Развернуть 1 комментарий

@mbarse, аааАаа. Просто оказалось, что в Амстердаме есть компания с таким же названием, и в гугле она выскочила у меня первой.

  Развернуть 1 комментарий

Как заботливо поставлены ударения в белках, чтобы никто не подумал что речь о бурундуках )

Спасибо за статью! Хорошо получилось передать атмосферу работы.

  Развернуть 1 комментарий
  Развернуть 1 комментарий
Akim Glushkov , Хитрый фрилансер 12 декабря 2021

Вау, с возвращением! Всегда было любопытно узнать что же делают все мокрые биологи, а тут все подробно, красочно, разжевано для простых людей по-пацански на пальцах.

Будто сам побывал рядом и провел эксперимент! (хотя не смыслю в хим-х экспериментах ничего)

  Развернуть 1 комментарий

Огромное спасибо за пост! Прочитал на одном дыхании, а схемы экспериментов просто ❤️

  Развернуть 1 комментарий
Антон Яценко , И швец, и жнец, и на дуде игрец 12 декабря 2021

Спасибо за пост! Сразу вспомнил как три года проводил свои дни схожим образом, пытаясь понять как меланома растёт в 3d-условиях )

  Развернуть 1 комментарий
Захар Кириллов , Амбассадор ЕРАМ в Клубе 12 декабря 2021

Ух, огонь!

Вопрос про автоматическую пипетку: а как вы их чистите? Они ведь поди многоразовые?

  Развернуть 1 комментарий

@zahhar, их не чистят, на любую операцию используют одноразовый стерильный носик, куда помешается нужный объем жидкости. Носики уходят тысячами. Для удобной смены, носики набиваются в специальные коробочки, их часто можно увидеть на фотографиях лабораторий рядом с пипетками.

  Развернуть 1 комментарий

@glebkudr, спасибо!

  Развернуть 1 комментарий

@zahhar, да, в повседневном пользовании как @glebkudr сказал, в норме внутрь пипетки ничего не попадает, а попадает только в одноразовый носик.

Если в пипетку что-то нечаянно попало, то нужно развинтить её на части, вымочить в ультразвуковой ванне и/или соответствующем химикате, автоклавировать (=обхреначить горячим водяным паром для стерилизации), высушить, собрать обратно.

  Развернуть 1 комментарий

Как обычно, схемы — отдельный офигенный огненный жанр!

  Развернуть 1 комментарий

Круто! Спасибо за рассказ, будучи человеком вне темы – витать безумно интересно было)

А можно вопрос «по теме»?:) Секвенирование гена какого-то – это прочтение его последовательности с целью нахождения ошибок? И что собой представляют эти «ошибки», как они выглядят? Сорри, просто с поломкой в BRCA1 всегда было интересно, что конкретно это означает, на таксказать, физическом уровне ))

  Развернуть 1 комментарий

@kocheva_lena, секвенирование гена какого-то — это прочтение его последовательности. Цель может быть разной. Если секвенируют человека на уровне генома (ДНК, «винчестера»), то да, в наши дни это делают с целью нахождения вариативностей — как безобидных, так и «ошибочных».

Если секвенируют человека на уровне транскриптома (РНК, «оперативной памяти»), то это обычно делают, чтобы прикинуть, чем таким занималась конкретная клетка, какие гены у неё в момент убийства любопытствующей учёной были не только на «винчестере», но и в «оперативной памяти». Впрочем, трюки для прикидывания геномных вариативностей на уровне транскриптома тоже есть.

Ген представляет собою линейную последовательность кодирующих что-то (например, белок BRCA1) элементов. Этих элементов 4 разновидности. Поэтому инфу из генов в человеко- и компьютерочитаемом формате очень удобно представлять в виде 4 разных букв, записанных в строку в соответствующем порядке: GCTGAGACTTCCTGGACGGGGGACA... (это начало гена BRCA1, полная его последовательность «без ошибок» лежит тут)

Если вы вдруг зададитесь вопросом, почему на схеме в моём посте ДНК двойная, а тут строка всего одна — так это потому, что вторая «строка» в ДНК несёт ту же инфу, что и первая. Бэкап как бы. Поэтому сразу две строки в контексте закодированной в них инфы обсуждать избыточно, достаточно одной.

«Ошибки» в гене могут быть разные. Может, например, выпасть одна или больше «букв». Может произойти вставка новых «букв». Может — замена одной «буквы» на другую.

Какая именно ошибка в BRCA1 у вас — я не могу без дополнительной инфы предположить, потому что их там бывает несколько десятков разных.

  Развернуть 1 комментарий

спасибо. интересно взглянуть на жизнь в лабе, когда сам только за компьютером сидишь, и занимаешься теорией :-)

  Развернуть 1 комментарий
Eugene Dmitrenko , Lead of infrastructure security 11 декабря 2021

Как классно! Спасибо! Я бы с удовольствием почитал и про другие дни научной деятельности, это жутко интересно.

  Развернуть 1 комментарий

Очень интересно, спасибо. А что ты думаешь про автоматические лабы типа https://www.emeraldcloudlab.com/ ?

  Развернуть 1 комментарий
  Развернуть 1 комментарий
Yury Katkov , миддл формошлёп 12 декабря 2021

Скажи, а вот замораживание до минус восьмидесяти разве не должно привести к повреждению клеток при разморозке? Там же наверное кристаллики льда рвут клеточную оболочку.

  Развернуть 1 комментарий

@ganqqwerty, если замораживать быстро, то ок. И сильно зависит от того, что за клетки. Кто-то выживает легко, кто-то дохнет.

  Развернуть 1 комментарий

@ganqqwerty, конкретно в пробирках, которые кинула на -80 я в этом эксперименте, клеток уже нет, там их лизат и чут чут кусат. Раствор, в который я их отправила перед этим, разрушил все клетки и стабилизировал их РНКу — тут мне тоже нужна была только она.

Ты прав, что, если кинуть животные клетки на -80 просто так в каком-нибудь водном растворе, то их порвёт льдом. Для защиты от кристалликов мы замораживаем клетки в 10% диметилсульфоксиде. Кстати, я не знаю, как именно он защищает от кристалликов, надо будет почитать.

Я удивилась, что @glebkudr говорит, что замораживать надо быстро, потому что в моём опыте работы с животными клетками замораживать их надо как раз-таки небыстро. Для замедления заморозки мы их кладём в специальные контейнеры с, я так понимаю, большой теплоёмкостью, и эти контейнеры не дают пробиркам с клетками охлаждаться быстрее, чем на 1 градус в минуту. До -80 клетки чилят в морозилке в этом контейнере, а через пару часов их можно переместить в конечное место хранения — жидкий азот (-180 градусов с копейками).

  Развернуть 1 комментарий

@e_rubecula, я под клетками имел ввиду бактерии, их как раз принято быстро замораживать. С животными не работал.

  Развернуть 1 комментарий

@ganqqwerty, у растений клеточная стенка, она рвется как лист бумаги (целлюлоза же), а у животных вместо стенки мембрана (что-то вроде мыльного пузыря) - она пластичная если без резких движений

  Развернуть 1 комментарий

Большое спасибо за статью, было интересно. Всегда эта область завораживала.

  Развернуть 1 комментарий

Потрясающе интересно. Спасибо!

  Развернуть 1 комментарий

😎

Автор поста открыл его для большого интернета, но комментирование и движухи доступны только участникам Клуба

Что вообще здесь происходит?


Войти  или  Вступить в Клуб